Diabetes Melitus merupakan penyakit metabolik yang menjadi salah satu penyakit serius di Indonesia, terutama diabetes melitus tipe 2. Pencegahan DM tipe 2 dapat dilakukan dengan menghambat enzim α-glukosidase sehingga absorpsi glukosa tertunda dan kadar glukosa darah dapat menurun. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dari ekstrak metanol, fraksi n-heksana, fraksi n-heksana : etil asetat, dan fraksi etil asetat daun Vitex trifolia L asal Yogyakarta. Uji aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase dilakukan secara in vitro dengan menggunakan substrat p-nitrofenil-α-glukopiranosida dan mengukur absorbansi p-nitrofenol sebagai produk reaksi enzimatis pada panjang gelombang 410 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat mengandung senyawa golongan flavonoid dan saponin. Nilai IC50 dari fraksi etil asetat yang dihasilkan adalah 691,8 ppm dan dikategorikan tidak aktif sebagai antidiabetes ketika dibandingkan dengan glukobay (sebagai kontrol) yang menghasilkan nilai IC50 sebesar 0,3259 ppm.