Bacillus cereus dan Pseudomonas aeruginosa merupakan contoh spesies bakteri yang dapat menyebabkan keracunan makanan. Deteksi bakteri pada makanan dapat dilakukan dengan metode PCR yang sudah teroptimasi dan tervaliditas untuk deteksi B. cereus dan P. aeruginosa. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan kondisi optimum dalam mendeteksi B. cereus dan P.aeruginosa dengan melakukan optimasi secara kualitatif molekuler berbasis PCR dan mendapatkan validitas dari metode tersebut atau membuktikan kinerja metode analisis yang akan digunakan. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi PROM, BPOM, Jakarta Pusat. Hasil optimasi konsentrasi primer menunjukkan bahwa deteksi gen motB pada B. cereus dan gen 16S rRNA pada P.aeruginosa telah dapat teroptimasi dan tervaliditas dengan metode PCR yang optimum pada kondisi konsentrasi primer 20 μM, konsentrasi DNA 50 ng/μL dan suhu annealing 550C (B. cereus) dan 590C (P. aeruginosa). Hasil validasi terhadap metode analisa pada masing-masing metode spesifik untuk deteksi B.cereus dan P. aeruginosa dengan menghasilkan LOD adalah 1 ng/μL dan 0,5 ng/μL, serta membuktikan metode analisa tersebut secara sensitifitas dan spesifisitas untuk deteksi B. cereus dan P. aeruginosa mencapai nilai 100% .