Salmonella typhimurium dan E. coli adalah bakteri patogen yang memiliki peran penting dalam penyebab keracunan makanan. Metode realtime PCR adalah metode pendeteksi yang dapat memantau secara langsung kemampuan primer dalam mengamplifikasi DNA bakteri target. Kecocokan antara primer dengan bakteri target sangat dibutuhkan sebagai awal untuk terjadinya proses amplifikasi. Penelitian ini betujuan untuk mendapatkan informasi tentang kemampuan primer gen fimC E. coli dan primer gen pef Salomonella thypimurium menggunakan metode realtime PCR. Pengujian kemampuan primer ditentukan berdasarkan akumulasi signal fluoresensi dari kurva amplifikasi yang menghubungkan jumlah Cycle threshold (Ct) terhadap intensitas signal produk amplikon yang dapat mencapai garis ambang batas. Primer gen fimC berhasil mengamplifikasi fragmen DNA E. coli pada Ct 12,25 sedangkan primer gen pef berhasil mengamplifikasi fragmen DNA S. thypimurium pada Ct 17,85. Hasil uji sensitivitas menyatakan bahwa konsentrasi template DNA 7,12 pg/ìL merupakan konsentrasi terendah bakteri target E. coli yang masih dapat terdeteksi oleh primer gen fimC dan konsentrasi 0,284 pg/ìL merupakan konsentrasi terendah bakteri target S. thypimurium yang masih dapat terdeteksi oleh primer gen pef. Hasil uji spesifisitas menunjukkan bahwa primer gen fimC spesifik mengenali template DNA bakteri target E. coli lebih cepat pada Ct 14, 05 dibandingkan DNA bakteri non target dengan nilai Ct 21,53 sedangkan primer gen pef menghasilkan spesifisitas yang rendah dengan nilai Ct yang dihasilkan bakteri non target 18,05 hampir sama dengan nilai Ct bakteri target pada Ct 17,65.